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实验室的PCR污染问题如何处理
点击次数:313 发布时间:2017-09-28

生物实验,大多数实验检测都是微观的,基于细胞,分子,蛋白水平,而这些微观样本对外界环境的影响敏感,比如温度、ph值、酶解、损伤等,在我们尽力呵护样本的生存环境的同时,污染也是需要注意的头等大事,要坚决避免环境中的“杂质”的乱入,包括样本污染,试剂仪器交叉污染、产物气溶胶污染等对实验结果的影响。“易查不易察”,污染来的悄无声息,防不胜防,假阳性结果让无数生物学子抓狂和崩溃。

在众多的生物实验室,分子生物学检测方法如PCR因其高灵敏度、快速、操作方便等优势已经被广泛应用,不过正是由于它灵敏度极高,极微量的污染源都有可能导致检测结果的假阳性,所以对环境污染的控制也极为严格。面对众多的污染源,比如样本交叉污染、试剂仪器交叉污染、克隆质粒污染、PCR扩增产物污染、还有极容易忽视的气溶胶污染,气溶胶是由固体或液体小质点分散并悬浮在气体介质中形成的胶体分散体系,在空气与液体面摩擦时,比如在操作时比较剧烈地摇动反应管,开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染。据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝,因而由其造成的污染是一个非常重要而被忽视的污染源。

虽然这些污染对PCR实验结果的影响已经受到了广泛重视,多数实验室对污染控制都采取了各种办法,比如定期大扫除清理、划分操作区域、试剂分装、操作谨慎、重复实验、多角度验证结果。但是微量的核酸片段就能被扩增,所以对污染物的控制不仅仅是做到这些就能够杜绝和避免的,关键是需要从源头控制。目前多数生物试验室,分子实验每天都在大规模进行,污染源已经无处不在,特异性的,非特异性的,同源的,非同源的,广泛分布在样本容器、实验室台面,试剂溶液中、仪器表面内管附着等等,你以为普通的清理就能解决这些污染源吗?必须是不行的,实验室大拿们都为了清除这些污染源研究出好多种方法,整理跟大家共享。

传统方式

原理

优势

不足

酒精擦拭

将核酸沉淀,擦拭后保证污染表面污染得到一定程度缓解

简单、方便、成本低

不彻底(核酸片段本身没有变化,仍然存在导致气溶胶污染的可能性)、细小孔径器材无法清除

修饰

标记遗传物质,阻止聚合酶与核酸的结合,从而抑制DNA扩增

效果相对好

反应可逆、成本高、试剂可能具有不安全影响

酶解

酶可将长链的核酸分子降解成小片段

速度快,效果相对较好

降解的核酸中仍有大片段存在,具有完整的遗传信息,可通过PCR扩增出完整的片段、成本高

高压变性

高压可将核酸降解成20~30bp的小片段

彻底,成本低

仅适用于耐高压材料,更无法应用实验操作台和大型的实验设备

紫外照射

PCR产物中嘧啶碱基会形成二聚体,延伸终止

方便,范围广,成本低

仅对500bp以上长片段有效,对短片段效果不大,且并不是DNA链中所有嘧啶均能形成二聚体,且UV照射还可使二聚体断裂

纵然有这么多解决核酸污染源的办法,但是大多数实验室却由于使用不方便、操作复杂、成本高、危害大而没有持续采用,实验室累积的污染也就越来越多,有些实验者甚至在ddH2O中扩增出了条带,结果可重复性差、投稿文章被质疑,不得不重新实验,当然在实验之前,必须要彻底清除这些污染源,这么严重的污染如何高效的清除,是一个迫在眉睫的问题。目前国外学者经过不断研发拓展,有一款清除剂DNA-ExitusPlus已经问世,并得到了Nature Methods的推荐,此款清除剂纯绿色配方,能够将污染源的核酸片段彻底降解成核苷酸为单位的极小片段,此过程不可逆,避免了污染重复的可能性,使用方便,使用与所有台面,仪器擦拭,小部件浸泡等,无污染,无腐蚀性,对人体无危害。简直是广大核酸污染受害者的福音啊。